中東呼吸綜合征冠狀病毒感染的常規(guī)檢測(cè)方法是通過(guò)實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄PCR 反應(yīng)和測(cè)序鑒定。有適當(dāng)經(jīng)驗(yàn)和生物安全條件的實(shí)驗(yàn)室可以嘗試用細(xì)胞分離病毒檢測(cè)，但不屬于常規(guī)檢測(cè)，本指南中未包含病毒分離的步驟。此外，鑒于我國(guó)尚無(wú)中東呼吸綜合征冠狀病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株和血清學(xué)檢測(cè)試劑，此版技術(shù)指南暫不包括血清學(xué)檢測(cè)內(nèi)容。

    任何中東呼吸綜合征冠狀病毒的檢測(cè)都必須在適當(dāng)條件的實(shí)驗(yàn)室由經(jīng)過(guò)相關(guān)技術(shù)安全培訓(xùn)的人員進(jìn)行操作。

目前病毒核酸的檢測(cè)方法主要有檢測(cè)E 蛋白上游基因（upE）、ORF1b 基因和ORF1a 基因三種。這些方法均高度敏感，檢測(cè)ORF1b 基因的方法不如針對(duì)ORF1a 的方法敏感，但比其更加特異。另外，已確定了中東呼吸綜合征冠狀病毒基因組中位于RNA 依賴(lài)的RNA 聚合酶（RdRp）和衣殼蛋白（N）基因的幾個(gè)適合測(cè)序驗(yàn)證的靶序列。

     在實(shí)驗(yàn)室要確認(rèn)一個(gè)樣本為陽(yáng)性，需要滿(mǎn)足以下兩個(gè)條件的其中

一個(gè)：

（一）至少兩種中東呼吸綜合征冠狀病毒特異性PCR 結(jié)果陽(yáng)性；

（二）一種PCR 結(jié)果為陽(yáng)性，另外一種PCR 產(chǎn)物序列測(cè)序，與已知序列相符。

     當(dāng)針對(duì)中東呼吸綜合征冠狀病毒的兩種不同的檢測(cè)方法結(jié)果不一致的時(shí)候，應(yīng)當(dāng)采用反轉(zhuǎn)錄PCR 擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序以確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果。

     陰性結(jié)果也不能排除臨床病人的感染，一些因素可能產(chǎn)生假陰性，包括：樣本質(zhì)量差，比如口咽等部位的呼吸道樣本；樣本收集的過(guò)早或過(guò)晚；沒(méi)有正確的保存、運(yùn)輸和處理樣本；技術(shù)本身存在的原因，如；病毒變異，PCR 抑制等。

     當(dāng)PCR 檢測(cè)結(jié)果為陰性，但臨床表現(xiàn)和流行病學(xué)特點(diǎn)提示是中東

呼吸綜合征冠狀病毒感染時(shí)，可采用血清學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)。雙份血清

標(biāo)本能夠滿(mǎn)足血清學(xué)檢測(cè)的要求。

熒光定量PCR 方法檢測(cè)中東呼吸綜合征冠狀病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)操作程序

1、目的

  規(guī)范熒光定量PCR 方法檢測(cè)中東呼吸綜合征冠狀病毒核酸的工

作程序，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確可靠。

2、范圍

  適用于熒光定量PCR 方法檢測(cè)中東呼吸綜合征冠狀病毒核酸。

3、職責(zé)

檢測(cè)人員：負(fù)責(zé)按照本檢測(cè)細(xì)則對(duì)被檢樣本進(jìn)行檢測(cè)。

復(fù)核人員：負(fù)責(zé)對(duì)檢測(cè)操作是否規(guī)范以及檢測(cè)結(jié)果是否準(zhǔn)確進(jìn)行

復(fù)核。

部門(mén)負(fù)責(zé)人：負(fù)責(zé)對(duì)科室綜合管理和檢測(cè)報(bào)告的審核。

4、樣本接收和準(zhǔn)備

4.1 核對(duì)被檢樣本姓名、性別、年齡、編號(hào)及檢測(cè)項(xiàng)目等。

4.2 待檢樣本的狀態(tài)如有異常，需注明。

4.3 待檢樣本應(yīng)存放于-70℃。

5、本方法檢測(cè)項(xiàng)目為中東呼吸綜合征冠狀病毒核酸測(cè)定（熒光

定量PCR 方法）

6、檢測(cè)儀器設(shè)備和材料

6.1 熒光PCR 檢測(cè)儀（ABI7000 或相似性能產(chǎn)品）

6.2 計(jì)時(shí)器

6.3 德國(guó)VITLAB移液器（10μl，100μl，1000μl），準(zhǔn)確度±2%

6.4 微型振蕩器

6.5 一次性手套

6.6 含氯消毒劑

7、檢測(cè)環(huán)境條件

實(shí)驗(yàn)應(yīng)在20℃-25℃室溫中進(jìn)行。

8、診斷試劑和材料

8.1 引物和探針：

upE：

upE-Fwd 5’-GCAACGCGCGATTCAGTT-3’

upE-Rev 5’-GCCTCTACACGGGACCCATA-3’

upE-Prb 5’FAM-CTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTCG-TAMRA 3’

ORF1b：

ORF1b-Fwd 5’-TTCGATGTTGAGGGTGCTCAT-3’

ORF1b-Rev 5’-TCACACCAGTTGAAAATCCTAATTG-3’

ORF1b-Prb 5’FAM-CCCGTAATGCATGTGGCACCAATGT-TAMRA 3’

8.2 QIAamp Viral RNA mini kit

8.3 PCR 反應(yīng)管：96 孔PCR 反應(yīng)板和透明封膜或PCR 反應(yīng)管和透

明蓋。

8.4 DEPC 水

8.5 AgPath one-step RT-PCR kit

9、檢測(cè)原理

Taqman 熒光探針為一段特異性寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒

光基團(tuán)和一個(gè)淬滅基團(tuán)。探針完整時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光被淬滅基

團(tuán)吸收；而PCR 擴(kuò)增時(shí)，聚合酶的5’-3’外切酶活性將探針切斷，

使熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，發(fā)射熒光。每一分子的產(chǎn)物生成都伴隨

著一分子的熒光信號(hào)產(chǎn)生，通過(guò)對(duì)熒光信號(hào)累積的監(jiān)測(cè)實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)

PCR 過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。該方法由于靶序列由引物和探針雙重控制，特

異性好，假陽(yáng)性低。

10、檢測(cè)步驟

10.1 病毒核酸（RNA）的制備：

10.1.1 樣本要求：咽拭子（或其他呼吸道樣本）；全血或血清。

10.2 準(zhǔn)備提取試劑（在使用前進(jìn)行）：

10.2.1 Buffer AVL 工作液的制備

將試劑盒提供的Buffer AVL 液1ml 加入到1 管凍干的Carrier

RNA 中, 混合均勻, 徹底溶解Carrier RNA。在第1 次使用前將溶解

的Carrier RNA 加入到1 瓶Buffer AVL 中, 制成Buffer AVL 工作液，

保存于2-8℃（穩(wěn)定性為48 個(gè)小時(shí)）。在2-8℃條件下, Buffer AVL/

Carrier RNA 混合物可能會(huì)析出沉淀, 可在使用前80℃溫育使之融

解。

10.2.2 Buffer AW1 工作液的制備

試劑盒中Buffer AW1 以濃縮液的狀態(tài)提供。第1 次使用前, 按

照試劑瓶上的說(shuō)明向其中加入規(guī)定量的無(wú)水乙醇制備成工作液。

Buffer AW1 工作液在室溫條件下可穩(wěn)定保存1 年。

10.2.3 Buffer AW2 工作液的準(zhǔn)備

試劑盒中Buffer AW2 以濃縮液的狀態(tài)提供。第1 次使用前, 按

照試劑瓶上的說(shuō)明向其中加入規(guī)定量的無(wú)水乙醇制備成工作液。

Buffer AW2 工作液在室溫條件下可穩(wěn)定保存1 年。

10.3 病毒核酸（RNA）提取步驟：

所有試劑在使用前應(yīng)平衡至室溫；所有離心步驟應(yīng)在室溫下進(jìn)

行。

10.3.1 取n＋1 個(gè)1.5ml 滅菌塑料離心管, 作好標(biāo)記。n=樣本數(shù)

10.3.2 每個(gè)塑料離心管加560ul Buffer AVL 工作液。

10.3.3 將140ul 待測(cè)樣本及對(duì)照樣本加到上述離心管中,振蕩

混勻15 秒, 室溫孵育10 分鐘。

10.3.4 短暫離心后加入560μl 無(wú)水乙醇, 振蕩混勻15 秒, 再

短暫離心。

10.3.5 取步驟10.3.4 得到的混合物630μl，加入到QIAamp RNA

提取柱中（帶有2ml 的集液管）, 蓋上管蓋，6000×g 離心1 分鐘。

10.3.6 更換新的集液管, 將10.3.4 剩余的樣本加入到QIAamp

RNA 提取柱中，蓋上管蓋，6000×g 離心1 分鐘。

10.3.7 更換新的集液管, 打開(kāi)管蓋, 加入500ul Buffer AW1 工

作液，6000×g 離心1 分鐘。

10.3.8 更換新的集液管, 打開(kāi)管蓋, 加入500ul Buffer AW2 工

作液，20000×g 離心3 分鐘。

10.3.9 更換新的集液管, 20000×g 離心1 分鐘。

10.3.10 將QIAamp RNA 提取柱置于新的1.5ml 離心管上, 小心

的打開(kāi)管蓋, 加入60μ1 洗脫液Buffer AVE, 蓋上管蓋, 室溫條件

下孵育1 分鐘, 6000×g 離心1 分鐘, 收集濾出液, 做好標(biāo)記, 4℃

保存?zhèn)溆谩?/span>

10.4 熒光定量PCR 檢測(cè)：

10.4.1 熒光定量RT-PCR 反應(yīng)液的準(zhǔn)備：

每個(gè)待檢樣本反應(yīng)液的組成為：

2×RT-PCR buffer：12.5μl

25×RT-PCR enzyme mix：1μl

引物（5mM）：各1μl

探針（5mM）：0.5μl

Detection enchancer：1.67μl

加水至20μl

10.4.2 每反應(yīng)管中加入待檢核酸5μl，蓋緊管蓋或封好透明膜,

置于PCR 檢測(cè)儀上。

10.4.3 擴(kuò)增條件設(shè)定：

45℃,10min；95℃,10min；95℃,15s,60℃,1min,共40 循環(huán)。

10.4.4 儀器檢測(cè)通道選擇：

使用ABI7000 熒光PCR 檢測(cè)儀時(shí)選擇Fam 熒光信號(hào),收集設(shè)在

60℃。具體設(shè)置方法請(qǐng)參照各儀器使用說(shuō)明書(shū)。

10.4.5 結(jié)果分析閾值設(shè)定：

使用ABI7000 熒光PCR 檢測(cè)儀進(jìn)行結(jié)果分析時(shí),基線（baseline）

取3-10 或6-15 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào),闕值設(shè)定原則以闕值線剛好超過(guò)

正常陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線的高點(diǎn),也可根據(jù)儀器噪音情況調(diào)整。

11、熒光定量RT-PCR 反應(yīng)系統(tǒng)的質(zhì)量控制：

反應(yīng)結(jié)果應(yīng)同時(shí)符合以下3 個(gè)條件，否則試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效。

11.1 陰性對(duì)照：無(wú)擴(kuò)增, 為陰性。

11.2 強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照：Ct 值<25。

11.3 臨界陽(yáng)性對(duì)照：Ct 值<35。

12、結(jié)果判斷：

12.1 陰性: 無(wú)Ct 值或Ct 為40。

12.2 陽(yáng)性：Ct 值<37, 可報(bào)告為陽(yáng)性。

12.3 Ct 值在37-40 之間的樣本建議重做, 若重做結(jié)果Ct 值< 37，

該樣本判斷為陽(yáng)性, 否則為陰性。